bebida enteogênica ameríndia conhecida como ayahuasca.

Neste trabalho, reunimos e anotamos os genomas organelares (ptDNA e mtDNA), apresentando os primeiros recursos genômicos para esta espécie. O ptDNA de P. viridis exibe 154.106 pb, codificando todo o repertório conhecido de genes de ptDNA encontrados em angiospermas.

A Psicotriagênero é um grupo parafilético complexo e, de acordo com análises filogenômicas, P. viridis está aninhado no clado Psychotrieae. Análises comparativas de ptDNA indicam que a maioria dos plastomas de Rubiaceae apresenta estruturas de ptDNA conservadas, muitas vezes mostrando pequenas diferenças nos locais de junção das quatro principais regiões (LSC-IR-SSC).

Para a mitocôndria, a análise baseada em gráfico de montagem suporta uma organização complexa do mtDNA, apresentando pelo menos duas estruturas mitogenômicas alternativas e circulares exibindo duas repetições principais abrangendo 24 kb e 749 pb que podem isomerizar simetricamente o mitogenoma em arranjos e isoformas variáveis. As sequências circulares de mtDNA (615.370 e 570.344 pb) codificam quase todos os genes mitocondriais de plantas (exceto para ccmC , rps7 ,rps10 , rps14 , rps19 , rpl2 e rpl16 que aparecem como pseudogenes, e os genes ausentes sdh3, rps2, rsp4, rsp8, rps11, rpl6 e rpl10 ), mostrando pequenas variações relacionadas a regiões exclusivas, integração de ptDNA e relíquias de eventos anteriores de integração LTR-RT. A detecção de dois haplótipos de mitogenomas é evidência de heteroplasmia, conforme observado pela organização complexa do genoma mitocondrial usando análise baseada em gráficos.

Tomados em conjunto, esses resultados fornecem informações primárias sobre a biologia do genoma e a história evolutiva de Psychotria viridis e podem ser usados ​​para auxiliar estratégias de conservação dessa espécie enteogênica sagrada.

Amostras de P. viridis foram coletadas no Núcleo Menino Galante localizado na Serra da Cantareira (São Paulo) (23.380562 S, 46.58857 W) com a colaboração da União do Vegetal (aprovação nº 23092021) e depositadas no Herbário JABU da Universidade Estadual Paulista (Unesp), campus Jaboticabal (voucher nº 3390). Para o P. viridissequenciamento do genoma, folhas frescas foram coletadas após 24 h de tratamento no escuro e submetidas a congelamento rápido em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C em um super freezer.

As amostras de plantas foram enviadas para o Arizona Genomics Institute (Tucson, AZ, EUA), onde uma extração de DNA de alto peso molecular (HMW) foi realizada usando um protocolo CTAB modificado. A qualidade do DNA HMW foi verificada quanto à concentração em um ensaio Qubit dsDNA de alta sensibilidade e razões de absorção (260/280 e 260/230 nm) em um espectrofotômetro NanoDrop NP-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EUA).

O tamanho do DNA foi validado por um Femto Pulse e eletroforese em gel de campo de pulso, e a pureza foi validada usando o teste de digestão com enzimas de restrição. O DNA HMW foi cortado na faixa de tamanho apropriada (10-30 kb) usando um Covaris g-TUBE, seguido de purificação do grânulo com PB Beads (PacBio, Menlo Park, CA, EUA) e construção de bibliotecas de acordo com o protocolo do fabricante usando um SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0. O sequenciamento foi realizado na plataforma PacBio Sequel IIe (modo CCS – leituras HiFi) no Arizona Genomics Institute (Tucson, AZ, EUA).

O genoma de ptDNA de P. viridis abrange 154.106 pb, exibindo um conteúdo de GC de 37,55% e uma estrutura quadripartida típica que codifica todo o repertório genético de ptDNA conhecido encontrado em organismos fotossintéticos (como mostra a foto desta reportagem).

Os genes mostrados na parte externa do mapa da imagem são transcritos no sentido horário, enquanto os genes no interior são transcritos no sentido anti-horário. Os genes são codificados por cores por sua função na legenda.

Análises filogenômicas baseadas em ptDNA agruparam todas as tribos como grupos monofiléticos e colocaram P. viridis na tribo Psychotrieae, irmã das tribos Spermacoceae e Moriendae. A estreita relação entre essas tribos já foi sugerida com base em marcadores nucleares e plastidiais ( Löfstrand, Razafimandimbison & Rydin, 2019 ; Razafimandimbison et al., 2020 , 2017). As principais diferenças estão relacionadas a Spermacoceae agrupadas com Psychotrieae, enquanto nos estudos anteriores, Moriendae está mais relacionado a Psychotrieae do que a Spermacoceae. A maioria das espécies de Moriendae são conhecidas como plantas medicinais no Sudeste Asiático, particularmente na medicina tradicional chinesa. No entanto, entre as três tribos próximas, apenas P. viridis é capaz de produzir alcalóides e DMT, tornando esta espécie particular em termos de conteúdo genético.

Psychotria viridis mtDNA apresenta uma estrutura complexa, composta por dois cromossomos circulares principais que são arranjados em várias isoformas e subcírculos.

Os genomas mitocondriais vegetais exibem uma mistura complicada de configurações e sequências físicas, mostrando assim conexões variáveis ​​e dinâmicas, como estruturas lineares ramificadas contendo concatemeros multigenômicos juntamente com formas circulares raras (Kozik et al., 2019) . Recentemente, foi proposto que as análises baseadas nas abordagens dos gráficos de montagem são válidas para visualizar a complexidade real das formas variáveis ​​do mtDNA da planta dentro das organelas mitocondriais (Fischer et al., 2022). As análises baseadas em gráficos também podem fornecer evidências suficientes para evitar a conclusão ingênua e errônea de que existe uma única molécula circular de mtDNA (Fischer et al., 2022 ; Kozik et al., 2019).

O gráfico de montagem do mtDNA de P. viridis apresenta duas estruturas alternativas e circulares mostrando 44,37% de conteúdo de GC, sugerindo que a heteroplasmia pode ser comum em plantas (Woloszynska, 2010). O haplótipo I do mtDNA abrange 615.370 pb e contém uma região repetida longa (24 kb), enquanto o haplótipo II do mtDNA abrange 570.344 pb e contém uma região repetida menor (740 pb). Regiões repetidas podem ser o substrato para diferentes recombinações homólogas ou outros eventos de recombinação que podem isomerizar e reorganizar simetricamente os mitogenomas (Sloan, 2013). Portanto, essas regiões repetidas podem suportar a existência de um espectro dinâmico de até 16 isoformas e até oito arranjos de subcírculos diferentes para cada haplótipo do mitogenoma. Todas essas variantes provavelmente coexistem in vivo. Além disso, a região repetida de 24 kb do haplótipo I do mtDNA codifica vários genes mitocondriais, resultando em um conjunto redundante de cópias de genes. Esse tipo de estrutura complexa é comumente encontrada em outros genomas mitocondriais de plantas e agora é considerada mais uma regra do que uma exceção que pode resultar de eventos mediados por repetição ou outros eventos de recombinação (Fischer et al., 2022 ; Kozik et al., 2019).

Em geral, os genomas de mtDNA de plantas carregam aproximadamente 40 genes codificadores de proteínas, um conjunto variável de tRNAs e a inserção de sequências relacionadas ao ptDNA como um produto da transferência lateral de genes endossimbióticos (Mower, Sloan & Alverson, 2012). O mtDNA de P. viridis segue essas tendências, codificando a maioria dos genes normalmente encontrados em genomas mitocondriais. A principal descoberta está relacionada à ausência dos genes rps2, rps11, rpl2, rpl6, rpl10 e rpl16, mas os genes ribossomais são altamente variáveis ​​nas angiospermas (Mower, Sloan & Alverson, 2012 ). Além disso, o sdh3 (Uniprot: P0DKI0 e GO:0000104 ), que codifica a subunidade do citocromo b da succinato desidrogenase, está ausente em ambas as versões dos mtDNAs de P. viridis, mas também em mitogenomas de outras plantas (isto é, Oryza sativa).

Em algumas plantas como Arabidopsis thaliana, esse gene foi integrado ao genoma nuclear (Mower, Sloan & Alverson, 2012), suportando um potencial mecanismo de redundância de função usando genes homólogos nucleares. Além disso, o gene nad5 , que é formado por cinco éxons, apresenta uma cópia duplicada dos éxons 1 e 2. Já nad5é processado por trans-splicing, esse achado pode sugerir a existência de caminhos transcricionais adicionais responsáveis ​​por unir os transcritos primários de RNA do spliceossomo no conjunto de mRNA nad5.

Outras características notáveis ​​estão relacionadas às diferenças entre os dois haplótipos do mtDNA, incluindo: a presença de uma LAGLIDADG homing endonuclease localizada apenas entre a região intrônica cox1 do mtDNA haplótipo I, e uma versão adicional e quimérica de nad4L (326 pb) identificada em cada um dos haplótipos do mtDNA. A LAGLIDADG homing endonuclease são enzimas de clivagem que geralmente são codificadas por íntrons, conferindo mobilidade de íntrons e geralmente encontradas em genomas mitocondriais fúngicos (Megarioti & Kouvelis, 2020). A presença do LAGLIDADG apenas no haplótipo I do mtDNA sugere transferência horizontal de uma espécie doadora de fungo, mas ainda mantendo os loci cox1 intactos no haplótipo II do mtDNA. Ambos nad4L quiméricos compartilham apenas os primeiros 16 aminoácidos, incluindo o códon de início, localizado no N-terminal da proteína. Curiosamente, uma inspeção de alinhamento mais detalhada no nad4L quimérico usando o UniProt Blast (Pundir et al., 2015), revela que, enquanto o terminal N da proteína (incluindo os 16 aminoácidos acima mencionados) correspondia a diferentes genomas mitocondriais de plantas (ou seja, Capsicum chinense, Nicotiana tabacum, Zea mays, Vitis vinifera, Glycine max, e muitos outros), o restante da proteína exibe correspondências com proteínas ortólogas de fungos, bactérias e nematoda (UniProt IDs: A0A2G9TNM8, A0A1Y1ZXS8, R6LZY0, A0A238BKX1 e A0A1Y2DMI6); assim, suportando uma estrutura quimérica possivelmente adquirida por transferência lateral.

Adicionalmente, o atp1 (1.776 pb) do haplótipo II é 405 pb mais longo que seu respectivo homólogo localizado no haplótipo I, indicando diferenças consideráveis ​​na proteína C-terminal. Usando a Arabidopsis thaliana atp1 (Uniprot: P92549 – 1.521 bp) como referência, observamos 95-96% de similaridade em quase todas as proteínas (do códon inicial até a posição 1.350), sustentando que P. viridis exibe de fato dois Domínios C-terminais da proteína Atp1. Portanto, é possível especular que essas diferenças possam impactar os complexos de transporte de elétrons da cadeia respiratória e a produção de ATP de forma única para essa espécie. Esta hipótese necessitará de uma investigação mais aprofundada.

Pequenas diferenças no gene nad1 também foram observadas. Por exemplo, o nad1 do haplótipo II carece de três nucleotídeos (AAT); no entanto, não afeta a tradução da proteína, tornando os dois genes 99% idênticos, apresentando apenas dois aminoácidos de diferença.

Várias sequências de ptDNA representando genes completos e fragmentados, e pseudogenes foram encontrados dispersos nos mitogenomas de P. viridis , respondendo por até 7,9 kb em cada haplótipo de mtDNA. Vale ressaltar que encontramos um gene quimérico formado pela fusão dos genes rpl2 e rpl23 do cloroplasto . Além disso, o gene da transcriptase reversa de splicing de íntrons do grupo II (ltrA), que é comumente observado no ptDNA de algumas Angiospermas, foi encontrado como um fragmento no mtDNA de P. viridis, e nenhuma sequência derivada de mitovírus foi identificada em P. viridismtDNA. Curiosamente, encontramos um gene que codifica uma potencial planta aconitato/2-metilaconitato hidratase, que está comumente envolvida com o ciclo do ácido tricarboxílico, o segundo estágio da respiração celular e o ciclo do glioxilato. Além disso, uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase vegetal envolvida na glicólise e um fator de alongamento relacionado à síntese proteica foram identificados em ambos os haplótipos dos mitogenomas, sugerindo aquisição a partir do genoma nuclear.

Finalmente, genes que codificam uma ribonuclease H e uma poliproteína desconhecida foram identificados em ambos os haplótipos do mtDNA. A presença desses genes é um claro indicador de um evento anterior de migração de TEs do genoma nuclear para o mitocondrial. De fato, várias cicatrizes de TEs foram identificadas no mtDNA de P. viridis, evidenciando assim que esses elementos móveis ajudaram a moldar a estrutura dos mitogenomas de chacrona.

Os resultados aqui apresentados trazem informações primárias sobre a biologia e estrutura do genoma da planta sagrada e enteogênica Psychotria viridis, um componente principal da bebida ayahuasca. Enquanto o ptDNA tem apresentado conteúdo gênico e organização conservados quando comparado a outras Rubiaceae, o genoma mitocondrial de P. viridis é heteroplásmico e tem se mostrado mais complexo, apresentando uma mistura dinâmica de formas. As versões completas do ptDNA e mtDNA aqui apresentadas são os primeiros recursos genômicos para esta espécie e podem ser mais exploradas para outros estudos populacionais, comparativos e evolutivos com o objetivo de fornecer estratégias para manejar e conservar a biodiversidade da chacrona.

Análises detalhadas do genoma nuclear de Psychotria viridis estão em andamento, e uma descrição completa de seu genoma nuclear será apresentada em publicações futuras.

Alessandro M. Varani
Saura R. Silva
Simone Lopes
Jose Beethoven Figueiredo Barbosa
Danilo Oliveira
Maria Alice Corrêa
Ana Paula Moraes
Vitor FO Miranda
Francisco Prosdocimi